Анастасия Александровна Пометун, Анна Андреевна Широкова, Наталия Павловна Галаничева, Леонид Александрович Шапошников, Денис Леонидович Атрошенко, Евгений Владимирович Пометун, Владимир Иванович Тишков⁷, Святослав Сергеевич Савин

Высокостабильная мутантная бактериальная формиатдегидрогеназа с улучшенными каталитическими свойствами

Аннотация. NAD⁺-зависимая формиадегидрогеназа (ФДГ, КФ 1.2.1.2) метилотрофных бактерий Pseudomonassp. 101 (PseFDH) имеет одно из самых высоких значений термостабильности среди всех известных ферментов этой группы. Введение в PseFDH ряда аминокислотных замен позволило получить многоточечный мутантный фермент PseFDHSM4S с еще более высокой температурной и химической стабильностью. Ранее нами было показано, что введение в PseFDHSM4S дополнительных отдельных точечных замен S131A, или S160A, или E170D приводит к еще большей стабилизации фермента. В настоящей работе на основе мутанта PseFDHSM4SS131A получены новые мутантные ФДГ, в которых по сравнению с PseFDHSM4S дополнительно введены двойная, тройная и четверная замены S131A/E170D (М2), S131A/S160A/E170D (М3) и S131A/S160A/E170D/S145A (PseFDHSM4A М3). Новые мутантные PseFDH были суперэкспрессированы в клетках E. coli, очищены и охарактеризованы. Замены S131A/E170D и S131A/S160A/E170D обеспечивают дальнейшее повышение термостабильности. Введение замены S145A в PseFDHSM4SM3 приводит к значительному снижению K_M^NAD+ и K_M^HCOO– при сохранении каталитической константы на прежнем уровне. Эта мутантная форма может быть успешно использована в системах регенерации NADH, а также для детекции NAD⁺ и формиата в биологических системах.
Ключевые слова: формиатдегидрогеназа, Pseudomonassp. 101, каталитические свойства, температурная стабильность, сайт-направленный мутагенез
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-2-99-111

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2023, том 64, № 2, стр. 99-111