Г.Ю. Ломакина, А.Д. Фомина, Н.Н. Угарова

Изучение кинетики взаимодействия дигитонина и его аналогов с клетками НЕК293 биолюминесцентным методом

Дигитонин (монодесмоидный сапонин) образует комплексы с холестерином клеточных мембран, что приводит к дезинтеграции структуры мембран, образованию пор и высвобождению внутриклеточных компонентов в реакционную среду. Для изучения кинетики начального этапа взаимодействия мембран клеток с дигитонином были использованы клетки линии НЕК293, транзиентно трансфицированные плазмидойpсDNALuc, экспрессирующей люциферазу светляков. Разработана методика непрерывного слежения за данным процессом биолюминесцентным методом, которая позволяет в режиме реального времени регистрировать кинетические кривые накопления во внеклеточном пространстве люциферазы и АТФ в присутствии дигитонина. Показано, что эффект влияния дигитонина на клеточные мембраны определяется его концентрацией в реакционной среде. При концентрациии менее 0,02 мМ наблюдается длительный период индукции, в течение которого белок не вытекает из клеток и образуются небольшие поры, проницаемые для низкомолекулярных соединений (АТФ). При повышении концентрации дигитонина до 0,05 мМ индукционный период сокращается и быстро возрастает концентрация высвобождаемой люциферазы, что свидетельствует об образовании крупных пор. Дигитонин наиболее токсичен для клеток при концентрации 0,08 мМ и более, когда в течение нескольких десятков секунд достигается максимальная концентрация высвобождаемых белков, а на кинетических кривых исчезает период индукции. Таким образом, биолюминесцентный метод позволяет изучать in situизменения проницаемости клеточных мембран под действием мембранно-активных эффекторов на ранних стадиях процесса лизиса клеток.
Ключевые слова: биолюминесценция, люцифераза светляков, клетки НЕК293, дигитонин, сапонины, цитотоксичность, проницаемость клеточных мембран.

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2020, том 61, № 3, стр. 232-242