В.Г. Григоренко, И.П. Андреева, О.В. Серова, М.Ю. Рубцова, А.М. Егоров

Роль остатка R65 в стабилизации β-лактамаз ТЕМ-типа с заменой М182Т

Для экспериментального изучения роли остатка R65 в стабилизации β-лактамаз с заменой М182Т, предсказанной на основе анализа сетей внутрибелковых взаимодействий, получены гомогенные препараты рекомбинантных β-лактамаз TEM-типа с заменами R65L, М182А и комбинацией мутаций R65L и М182Т. Определены кинетические параметры данных ферментов по таким субстратам, как пенициллин, цефтазидим, цефалотин и CENTA. Показано, что все исследованные замены не изменяют субстратную специфичность ферментов в отношении β-лактамных антибиотиков. Замена R65L приводит к уменьшению термостабильности, замена М182А и сочетание замен R65L и М182Т приводит к увеличению термостабильности β-лактамазы по сравнению с ферментом дикого типа ТЕМ-1. Методом дифференциально сканирующей калориметрии определены энтальпия (ΔH, кДж/моль) и температура денатурации (Т_пл., °С) для β-лактамаз ТЕМ-1, ТЕМ(М182А), ТЕМ-135(М182Т), ТЕМ(R65L+М182Т), которые составляют соответственно 554,0 и 50,8; 573,7 и 51,7 кДж/моль; 654,4 и 55,9; 647,4 и 51,9 °С. Полученные данные дополняют представления о молекулярном механизме стабилизирующей роли мутации M182T, заключающейся в изменении конформации остатка R65 и возникновении его новых контактов с остатками Ω-петли β-лактамазы.
Ключевые слова: рекомбинантные β-лактамазы TEM-типа, мутации, термостабильность, сети внутрибелковых взаимодействий.

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2020, том 61, № 3, стр. 223-231