Метаболизм. Ферменты
Лактатдегидрогеназа: механизм каталитической реакции
Механизм действия лактатадегидрогеназы (ЛДГ) можно представить
на основе общих закономерностей ферментативного катализа, которые изложены на
с. 96.
А. Лактатдегидрогеназа: каталитический
цикл
ЛДГ катализирует передачу восстановительного
эквивалента от лактата на НАД+ (NАD+) или от НАДН (NADH)
на пируват.
L-лактат + НАД+ ↔ пируват + НАДН
+ H+
Равновесие реакции сдвинуто в сторону образования лактата (см.
с. 24). Однако при высоких концентрациях лактата и НАД+
возможно окисление лактата в пируват. ЛДГ катализирует реакцию в обоих направлениях,
но подобно всем ферментам не влияет на положение химического равновесия.
Из-за обратимости реакции каталитический
процесс можно представить в виде движения по кругу. Каталитический цикл
ЛДГ представлен на схеме в виде шести моментальных «снимков». Приведенные на
схеме промежуточные стадии катализа очень кратковременны и поэтому строго не
доказаны. Однако их существование подтверждается множеством экспериментальных
данных
В активном центре ЛДГ принимают участие многие аминокислотные
остатки. Они способствуют присоединению субстратов и кофермента или непосредственно
участвуют в одной из стадий катализа. Здесь показаны лишь три особенно важные
боковые цепи аминокислот: положительно заряженная гуанидиновая группа аргинина-171
связывает карбоксильную группу субстрата с помощью электростатического взаимодействия,
имидазольная группа гистидина-195 принимает участие в кислотно-основном
катализе, боковая цепь аргинина-109 важна для стабилизации переходного
состояния. В противоположность His-195, меняющему свой заряд во время катализа,
оба упомянутых остатка аргинина протонированы постоянно. Кроме этих трех остатков
важную роль играет пептидная петля 98-111, показанная схематически (окрашена
в малиновый цвет) на рис. 103. Ее функция состоит в том,
чтобы после связывания субстрата и кофермента закрыть активный центр и исключить
доступ молекул воды во время переноса электронов.
Рассмотрим теперь отдельные стадии катализируемого ЛДГ восстановления
пирувата: в свободном ферменте (1) His-195 протонирован,
в связи с чем эта форма обозначена как E ∙ H+ . Кофермент НАДН
связывается первым (2), а за ним - пируват (3)
Важно, что в молекуле фермента карбонильная группа пирувата и никотинамидное
кольцо кофермента в активированном состоянии расположены друг относительно друга
оптимально и такая ориентация фиксирована (сближение и ориентирование субстратов).
Затем закрывается петля 98-111 над активным центром. Сильно пониженная полярность
в области активного центра облегчает образование переходного состояния (4;
доступ воды закрыт). В переходном состоянии гидрид-ион H-
(см. с. 104) переносится с кофермента на карбонильный
углерод (перенос группы). При этом временно образующийся энергетически
невыгодный отрицательный заряд на кислороде стабилизируется электростатическим
взаимодействием с Arg-109 (стабилизация переходного состояния). Одновременно
осуществляется перенос протона с Нis-195 на атом кислорода (перенос группы),
приводя к образованию связанных с ферментом лактата и НАД+ (5).
После открытия петли лактат диссоциирует с фермента и временно незаряженная
имидазольная группа Нis-195 снова присоединяет протон из окружающей воды (6).
Наконец, освобождается также окисленный кофермент НАД+ и снова достигается
исходное состояние (1). При окислении лактата в
пируват протекают то же стадии, но в противоположном направлении
Входящий в уравнение реакции протон
присоединяется не одновременно с NADH а после освобождения лактата, т. е. между
стадиями (5) и (6) предшествующего цикла.