Павел Дмитриевич Паршин, Устина Александровна Мартысюк, Денис Леонидович Атрошенко, Анна Владимировна Попинако, Святослав Сергеевич Савин, Евгений Владимирович Пометун, Владимир Иванович Тишков, Анастасия Александровна Пометун

Исследование механизма коферментной специфичности фенилацетонмонооксигеназы из Thermobifidafusca методом направленного мутагенеза

Аннотация. Фенилацетонмонооксигеназа из Thermobifida fusca (КФ 1.14.13.92, PAMO) принадлежит к семейству монооксигеназ Байера–Виллигера и катализирует реакции окисления различных ароматических кетонов до соответствующих сложных эфиров с использованием NADPH в качестве кофактора. В работе проанализирована структура центра связывания кофактора, выбраны наиболее важные для узнавания фосфатной группы кофактора аминокислотные остатки и проведено моделирование аминокислотных замен, потенциально способных привести к изменению коферментной специфичности фермента от NADPH к NADH. На основе проведенного моделирования предложены наиболее перспективные аминокислотные замены T218D, T218E, K336A, K336R. С помощью направленного мутагенеза получены генетические конструкции, которые содержат гены, кодирующие PAMO с соответствующими аминокислотными заменами, проведены экспрессия и очистка ферментов. Полученные мутантные PAMO способны связывать NADH, но не обладают способностью катализировать окисление бензил-ацетона в присутствии NADH и демонстрируют ухудшение констант Михаэлиса по NADPH. Каталитические константы изучаемых мутантных ферментов немного уменьшаются, однако это изменение находится в пределах погрешности эксперимента.
Ключевые слова: фенилацетонмонооксигеназа, монооксигеназа Байера–Виллигера, белковая инженерия, направленный мутагенез, коферментная специфичность

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2022, том 63, № 5, стр. 334-343