А.А. Пометун, К.М. Бойко, С.А. Зубанова, А.Ю. Николаева, Д.Л. Атрошенко, С.С. Савин, В.И. Тишков

Получение рекомбинантной формиатдегидрогеназы из термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1 и кристаллизация апо- и холо-форм фермента

NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа из термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1 (OpaFDH, КФ 1.2.1.2) c дополнительным остатком глицина на N-конце и ее двойной мутант OpaFDH_AD были экспрессированы в клетках E. coli c выходом по активности более 6000 ед. на 1 л среды. Ферменты были очищены до гомогенного состояния с выходом 62%. Методика выделения включала разрушение клеток ультразвуком, термообработку бесклеточного экстракта при 55 ^оС в течение 15 мин и гидрофобную хроматографию на Phenyl Sepharose Fast Flow. Проведены эксперименты по кристаллизации как свободной OpaFDH, так и в присутствии субстрата NAD⁺ и конкурентного по формиату ингибитора азид-иона (апо- и холо-формы соответственно), однако были получены кристаллы только апо-формы фермента размером 50×50×20 мкм. Кристаллы холо-OpaFDH дикого типа получить не удалось. Поэтому далее для получения кристаллов холо-формы использовали мутантную OpaFDH_AD, в который по сравнению с исходным ферментом улучшены показатели температурной и химической стабильности. В результате были получены кристаллы для холо-форм OpaFDH_AD. Кристаллы как апо-, так и холо-формы имеют достаточное качество для сбора дифракционных данных и последующего определения трехмерной структуры.
Ключевые слова: формиатдегидрогеназа, Ogataea parapolymorpha DL-1, выделение и очистка, мутантный фермент, кристаллизация.

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2021, том 62, № 2, стр. 130-138