[На предыдущую часть]

Рассмотрим экспериментальные доказательства основных постулатов мембранного механизма действия НИЛИ. В качестве объекта исследования в экспериментах использовали полимофноядерные лейкоциты крови пациентов. Выбор объекта диктовался простотой методики определения функциональной активности фагоцитов. Уровень спонтанной и стимулированной активности фагоцитов определяли, измеряя люминол-зависимую хемилюминесценцию (ЛХЛ) [26–28]. Принцип метода состоит в том, что в процессе стимуляции фагоциты (рис. 1) продуцируют большое количество различных прооксидантов (активные формы кислорода, гипохлорит и др.), способных, в процессе взаимодействия с люминолом, генерировать мощную так называемую люминол-зависимую хемилюминесценцию (ЛХЛ), интенсивность которой пропорциональна функциональному статусу клеток.

Прежде всего важно было выяснить к каким функциональным изменениям может приводить ЛО суспензии фагоцитов? Опыты проводились следующим образом (рис. 2). В контроле суспензию лейкоцитов инкубировали в темноте определённое время, равное времени экспозиции при лазерном облучении в опыте. После чего в суспензию вводили люминол в конечной концентрации 10^–5М, рецептор-опосредованный стимулятор фагоцитов, опсонизированный зимозан (ОЗ) и измеряли интенсивность ЛХЛ (Хл-ответ). В опыте суспензию лейкоцитов облучали гелий-неоновым лазером. Доза лазерного облучения подбиралась такой, чтобы световое воздействие не оказывало сколько-нибудь значительного влияния на функционирование фагоцитов. Однако если после такого ЛО ввести в суспензию обычную концентрацию стимулятора, то хемилюминесцентный ответ фагоцитов увеличивается. Отношение амплитуды Хл-ответа ПМЛ после ЛО к интенсивности ЛХЛ гранулоцитов в контроле в дальнейшем будем называть индексом прайминга (ИП).

В процессе работы (данные получены совместно с к.б.н И.В. Бабенковой и И.А. Страшкевич) было обнаружено (рис. 3), что при использовании клеток лейкомассы, выделенной из крови больных с бронхолёгочными заболеваниями, ЛО с длиной волны 632,8 нм вызывало дозо-зависимое увеличение индекса прайминга лейкоцитов с последующим ингибированием Хл-ответа лейкцитов при дальнейшем увеличении времени экспозиции ЛО. Выраженность формирования прайминга фагоцитов крови пациентов с разной патологией была различной. Так, в случае использования клеток лейкомассы крови больных с острой пневмонией максимальное превышение амплитуды ЛХЛ лейкоцитов над контролем, наблюдавшееся при дозе ЛО 0,12 Дж/см², составило 77± 13% (рис. 3A). Дальнейшее увеличение дозы ЛО приводило к дозо-зависимому ингибированию активности клеток. В другом случае, когда использовали лейкоциты, выделенные из крови больных тяжелой полисегментарной пневмонией в хронической фазе заболевания (рис. 3B), превышение Хл-ответа клеток после ЛО на стимуляцию, по сравнению с контролем, составило лишь 20± 5% и наблюдалось при более высокой дозе ЛО, 0,15 Дж/см², с последующим ингибированием при более высоких дозах светового воздействия. ЛО лейкоцитов, выделенных из крови больных хроническим бронхитом, не приводило к сколько-нибудь значительному изменению интенсивности Хл-ответа клеток на последующую стимуляцию по отношению к контролю (рис. 3C). Иными словами, ЛО клеток лейкомассы, выделенных из крови разных пациентов, вызывает различные изменения в функциональном потенциале лейкоцитов. Это может быть следствием того, что в исследуемых популяциях клеток содержится различное количество предполагаемого хромофора, эндогенных порфиринов. В том случае, когда клетки могли содержать достаточное количество порфиринов, в результате их взаимодействия с ЛИ происходит значительная продукция активных форм кислорода, в частности ¹О₂, которые, в свою очередь, инициируют перекисную модификацию клеточных мембран и увеличение содержания ионов кальция в цитоплазме, что является необходимым и достаточным условием для формирования прайминга лейкоцитов [26–29]. В тех случаях, когда содержание эндогенных порфиринов в лейкоцитах мало, ЛО не способно увеличивать функциональный потенциал лейкоцитов, либо это увеличение проявляется в меньшей степени.

Поскольку определение концентрации эндогенных порфиринов в лейкоцитах, как возможных первичных акцепторов ЛИ, сопряжено с большими методическими трудностями, главным образом из-за малого их содержания, то для доказательства высказанного предположения об участии эндогенных фотосенсибилизаторов в дальнейших экспериментах мы использовали экзогенный фотосенсибилизатор, фталоцианин, применяемый при фотодинамической терапии опухолей [1–4]. В специальных опытах была выбрана оптимальная концентрация фталоцианина, которая, с одной стороны, обладала минимальной темновой цитотоксичностью, а с другой – вызывала лазер-индуцированную модификацию функциональной активности лейкоцитов. Было обнаружено (рис. 3A), что ЛО клеток лейкомассы, выделенных из крови больных острой пневмонией, в присутствии 8,65{U 8729}10^–9М фталоцианина вызывало увеличение функционального потенциала лейкоцитов, но значительно в меньшей степени по сравнению с контролем (25± 5% против 77± 13% в контроле). При этом максимум Хл-ответа фагоцитов в присутствии экзогенного фотосенсибилизатора сдвигался в сторону меньших доз ЛО (0,05 Дж/см²) Если же фталоцианин вводили в суспензию клеток, исходно слабо отвечающих на ЛО (рис. 3B), то выраженность Хл-ответа на последующую после ЛО стимуляцию увеличивалась до 80% (в контроле 20%). И опять, максимум Хл-ответа клеток сдвигался в сторону меньших доз ЛО (0,05 Дж/см²). И наконец, когда экзогенный фотосенсибилизатор ввели в суспензию клеток лейкомассы, выделенных из крови больных хроническим бронхитом (рис. 3C), которые в контроле совсем не отвечали на ЛО, происходила реанимация Хл-ответа на световое воздействие. В связи с этим можно думать, что содержащийся в лейкоцитах эндогенный или экзогенный фотосенсибилизаторы могут выступать в зависимости от концентрации в виде триггера изменения функционального потенциала фагоцитов в процессе светового воздействия.

Вместе с тем известно, что эндогенные порфирины в циркуляции крови связаны в основном с липопротеидами и белками плазмы [30] и в меньшей степени с мембранами клеток крови [31]. Отсюда возникает вопрос: где должен быть локализован эндогенный хромофор с тем, чтобы вызывать увеличение функционального потенциала лейкоцитов крови при лазерном облучении in vivo? Принципиально может существовать, как минимум, два возможных варианта:

Предварительно в плазме крови этих пациентов определяли концентрацию порфиринов и фталоцианина спектрофлуориметрическим методом [32].

В первой серии экспериментов использовали клетки лейкомассы и плазму крови онкологических больных, прошедших процедуру лазерного облучения по методу ФДТ опухолей в центре лазерной медицины (Москва) с внутривенно введенным фталоцианином (ФЦ). Зная исходную концентрацию ФЦ в плазме крови этих больных, пересчитывали количество молей ФЦ, находящегося в 20 мкл добавленной к клеткам плазмы. На рис. 4А представлена дозовая зависимость ЛО на стимулированный Хл-ответ ПМЛ лейкомассы крови больного с плоскоклеточным раком в присутствии 20 мкл плазмы этого же больного, в которой содержалось 0,52{U 8729}10^–12 молей ФЦ. Видно, что по мере увеличения дозы ЛО происходит возрастание Хл-ответа ПМЛ на последующую после ЛО стимуляцию опсонизированным зимозаном (ОЗ), максимальная интенсивность ЛХЛ ПМЛ наблюдалась при дозе 0,6 Дж/см² и составляла более 50%. Дальнейшее увеличение времени экспозиции ЛО сопровождалось дозо-зависимым ингибированием Хл-ответа лейкоцитов. При этом с помощью теста с трипановым синим было показано, что ингибирование активности ПМЛ не связано с потерей жизнеспособности клеток. Облучение клеток лейкомассы в растворе Хенкса без добавленной плазмы в пределах использованных доз ЛО приводило к незначительному изменению величины Хл-ответа.

Следует подчеркнуть, что само по себе ЛО не действовало на уровень спонтанной ЛХЛ ПМЛ, а проявлялось только лишь при последующей стимуляции. Иными словами, ЛО лейкоцитов в присутствии плазмы, содержащей определенное количество фотосенсибилизатора (Ф/С), вызывало увеличение способности клеток отвечать большей продукцией различных прооксидантов на последующую стимуляцию, т.е. увеличение функционального потенциала клеток, качественно совпадающий с ситуацией, когда к лейкоцитам вводили экзогенный ФЦ. Важно было выяснить, как влияет ЛО на функционирование лейкоцитов в условиях разного содержания в добавляемой плазме Ф/С. На рис. 4Б представлены результаты влияния одинакового объема (20мкл) плазмы крови разных онкологических больных на Хл-ответ ПМЛ после ЛО в одной и той же дозе. Видно, что по мере увеличения количества ФЦ в добавляемой плазме – от 0,05·10^–12 до 1,2·10^–12 молей – при ЛО в дозе 0,6 Дж/см² интенсивность ЛХЛ ПМЛ на последующую стимуляцию ОЗ возрастала от 7± 2% до 77± 5% по отношению к контролю, а затем при дальнейшем увеличении содержания Ф/С в добавляемой плазме выходила на стадию насыщения, проявляя тенденцию к ингибированию.

[На следующую часть] [На Список литературы]

Copyright ©