ChemNet
 
[На предыдущую главу]
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе процесс сворачивания и самоассоциации при самосборке нативной структуры апоЕ был изучен при одновременном измерении эффективности переноса энергии, анизотропии, интегральной интенсивности флуоресценции и степени доступности флуоресцеиновых хромофоров для анионов тушителя I. Выбранная донор-акцепторная пара дансил-флуоресцеин (рис. 1, рис. 2) часто используется при измерении переноса энергии [13,14,18]. Для измерения эффективности переноса была изучена сенсибилизированная флуоресценция акцептора при возбуждении в полосе поглощения донора (рис. 2), а не тушение свечения донора, так как на последний процесс часто оказывают влияние различные посторонние факторы [21]. Нами обнаружен эффективный перенос энергии в растворе между дансил- и флуоресцеин-меченными молекулами апобелка при низких (<0,6 мкМ) концентрациях апоЕ (рис. 3), когда перенос за счет диффузии [21] отсутствует, и регистрируемый процесс может отражать лишь самоассоциацию. Действительно, в жидких растворах перенос между донор-акцепторной парой наблюдается в области концентраций акцептора, обычно превышающих 10–3 М [21]. В случае взаимодействия донор- и акцептор-меченной молекул перенос энергии зависит от степени мечения акцепторными группами и от геометрии комплекса [18]. Свидетельством существования самоассоцииированной формы апоЕ в растворе служат полученные в нашей работе данные о зависимости величины E от относительного содержания флуоресцеин-меченных молекул апоЕ в донор-акцепторном комплексе (рис. 3) и от степени мечения апобелка флуоресцеином. В то же время, даже при знании геометрии комплекса, можно лишь рассчитать средние межмолекулярные расстояния между индивидуальными молекулами в комплексе [18]. Мы использовали апобелок с большой стехиометрией мечения (4–12 молекул метки/молекулу белка) для измерения возможных изменений расстояния между центрами “светящихся сфер”, т.е. ассоциации/диссоциации, а не для детализации вариаций геометрических форм апобелка при селективном одиночном мечении [18]. Отметим, что при высокой стехиометрии мечения величины r для флуоресценции апоЕ/Ф (см. таблицу) не отличалось от величины анизотропии флуоресценции апобелка, содержащего в среднем меньше 1 молекулы метки/молекулу белка [6], т.е. отсутствовала деполяризация флуоресценции за счет переноса энергии между несколькими молекулами флуоресцеина, расположенными на одиночной молекуле апобелка.

Несмотря на некоторую неопределенность в определении меж- и внутримолекулярных расстояний измерением переноса энергии, связанную в первую очередь с отсутствием информации о величине фактора ориентации k [15,18], такого рода измерения могут быть весьма полезны для быстрого полуколичественного анализа величин расстояний. Тетрамерная форма организации апоЕ в растворе продемонстрирована в нашем предыдущем исследовании [6], а также в работах других авторов [4, 5, 22] с использованием анизотропии флуоресценции апоЕ/F [6], гель-фильтрации [5,6,22], “сшивающих” агентов (рис. 4, [5,6]) и седиментационного анализа [5].

Существенно более выраженное снижение интенсивности флуоресценции флуоресцеиновых групп при холодовой ренатурации апобелка, после его денатурации гуанидин-гидрохлоридом (данные не приведены) или после мономеризации холатом Na (см. таблицу), по сравнению с изменением интенсивности свечения при инкубации при 24°С указывает на наличие промежуточной стадии в сворачивании самоассоциированной формы апоЕ. Этот конформационный переход происходит именно в самоассоциированной, а не в мономерной форме апоЕ из-за быстрой самоассоциации в исследованной области концентраций в физиологических условиях [6]. Обратимое снижение интенсивности флуоресценции флуоресцеинового хромофора при ренатурации апоЕ/Ф регистрировалось и в нашей предыдущей работе по денатурации/ренатурации апобелка, измеренных в равновесных условиях [6]. Можно полагать, что холодовая инкубация сопровождается накоплением “открытого” конформера тетрамера апоЕ. Тепловая инкубация приводит к переходу “открытого” конформера самоассоциированной формы апобелка в “закрытый”, т.е. схему поведения апоЕ в растворе, предложенную нами ранее [6], можно дополнить на основании равновесных измерений: олигомер (при старении препарата)  тетрамер “закрытый”  тетрамер “открытый”  нативный или частично денатурированный мономер  полностью денатурированный мономер.

Какова же природа сил, стабилизирующих надмолекулярную структуру апобелка при его самосборке в растворе? Отмеченная разница в температурной зависимости изменения интенсивности флуоресценции апоЕ/Ф указывает на вовлеченность гидрофобных взаимодействий. Известно, что гидрофобное “сцепление”, возникающее между алифатическими радикалами, более стабильно при комнатной температуре, чем при 0°С, из-за эндотермичности перехода от воды к неполярному растворителю для этих групп [19]. Именно этим объясняется факт холодовой денатурации многих белков [20]. Предположению о вовлеченности гидрофобных взаимодействий в процесс структурирования тетрамера апоЕ соответствуют данные о значительном снижении доступности флуоресцеинового хромофора для анионов I при инкубации апобелка при 24°С, по сравнению с отсутствием изменений доступности при инкубации при 0°С (см. таблицу). В то же время нельзя исключить и участия спаривания зарядов при самоассоциации апоЕ, так как “сшивка” водорастворимым карбодиимидом приводила к образованию тетрамерной формы апоЕ (рис. 4). Увеличенным структурированием, т.е. большей плотностью упаковки белковой молекулы при 24°С, объясняется и снижение величины r при инкубации апоЕ/Ф при 24°С и отсутствие заметных изменений этого параметра за 6 часов инкубации при 0° (см. таблицу). Отметим, что падение анизотропии флуоресценции вряд ли можно объяснить снижением интегральной интенсивности, так как снижение квантового выхода может сопровождаться лишь уменьшением времени жизни возбужденного состояния, что может приводить лишь к росту величины r. Структурирование тетрамерной формы апоЕ с образованием и конденсацией гидрофобного “ядра”, вместе с тем, не приводит к заметным изменениям расстояний между центрами “светящихся сфер” – отдельных молекул апоЕ в тетрамерном ассоциате – так как величина E не изменялась при инкубации при обеих температурах (см. таблицу). Из этого также следует, что в изученном временном интервале не наблюдалось и значительной самоассоциации в более высокомолекулярные олигомерные формы апобелка. Открытым остается вопрос о достижении равновесной ситуации по разным флуоресцентным параметрам (см. таблицу). Если по результатам измерения r можно полагать, что достигается равновесие после 6 часов инкубации при 24°С, то интенсивность флуоресценции апоЕ/Ф продолжала падать. Требуется более детальное изучение кинетики изменения различных параметров.

Биологическая значимость обнаруженной надмолекулярной организации апоЕ в растворе может заключаться в контролировании встраивания молекул апобелка в липидную фазу липопротеидных частиц и клеточных мембран и контролировании степени агрегированности апобелка в липиде, что, в свою очередь, может определять эффективность взаимодействия апоЕ-содержащей липопротеидной частицы с В,Е- или Е-рецепторами. Выявленный в данном исследовании факт медленного сворачивания апоЕ после действия детергента поднимает вопрос о равновесном состоянии апобелка в апоЕ-фосфолипидных рекомбинантах, полученных при диализе из детергентного раствора. Эти структуры могут быть кинетически нестабильны, если сворачивание апобелка в липидной фазе напоминает его самоассоциацию в растворе. Конформационно неустойчивым может быть также апобелок после диссоциации от поверхности ЛОНП и хиломикронов при их липолизе, и взаимодействие липид-свободного апоЕ с сывороточным альбумином, показанное нами [23], может тогда стабилизировать структуру апоЕ в сыворотке.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований, грант 98-04-48060.

[На список литературы] [На оглавление] [На список сокращений и обозначений]

Copyright ©




Сервер создается при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
Не разрешается  копирование материалов и размещение на других Web-сайтах
Вебдизайн: Copyright (C) И. Миняйлова и В. Миняйлов
Copyright (C) Химический факультет МГУ
Написать письмо редактору