[На
предыдущую главу]
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В настоящей работе процесс сворачивания и самоассоциации при самосборке
нативной структуры апоЕ был изучен при одновременном измерении эффективности
переноса энергии, анизотропии, интегральной интенсивности флуоресценции
и степени доступности флуоресцеиновых хромофоров для анионов тушителя I–.
Выбранная донор-акцепторная пара дансил-флуоресцеин (рис.
1, рис.
2) часто используется при измерении переноса
энергии [13,14,18]. Для измерения эффективности переноса была изучена сенсибилизированная
флуоресценция акцептора при возбуждении в полосе поглощения донора (рис.
2), а не тушение свечения донора, так как на последний процесс часто
оказывают влияние различные посторонние факторы [21]. Нами обнаружен эффективный
перенос энергии в растворе между дансил- и флуоресцеин-меченными молекулами
апобелка при низких (<0,6 мкМ) концентрациях апоЕ (рис.
3), когда перенос за счет диффузии [21] отсутствует, и регистрируемый
процесс может отражать лишь самоассоциацию. Действительно, в жидких растворах
перенос между донор-акцепторной парой наблюдается в области концентраций
акцептора, обычно превышающих 10–3
М [21]. В случае взаимодействия донор- и акцептор-меченной молекул перенос
энергии зависит от степени мечения акцепторными группами и от геометрии
комплекса [18]. Свидетельством существования самоассоцииированной формы
апоЕ в растворе служат полученные в нашей работе данные о зависимости величины
E от относительного содержания
флуоресцеин-меченных молекул апоЕ в донор-акцепторном комплексе (рис.
3) и от степени мечения апобелка флуоресцеином. В то же время, даже
при знании геометрии комплекса, можно лишь рассчитать средние межмолекулярные
расстояния между индивидуальными молекулами в комплексе [18]. Мы использовали
апобелок с большой стехиометрией мечения (4–12 молекул метки/молекулу белка)
для измерения возможных изменений расстояния между центрами “светящихся
сфер”, т.е. ассоциации/диссоциации, а не для детализации вариаций геометрических
форм апобелка при селективном одиночном мечении [18]. Отметим, что при
высокой стехиометрии мечения величины r
для флуоресценции апоЕ/Ф (см. таблицу) не отличалось
от величины анизотропии флуоресценции апобелка, содержащего в среднем меньше
1 молекулы метки/молекулу белка [6], т.е. отсутствовала деполяризация флуоресценции
за счет переноса энергии между несколькими молекулами флуоресцеина, расположенными
на одиночной молекуле апобелка.
Несмотря на некоторую неопределенность
в определении меж- и внутримолекулярных расстояний измерением переноса
энергии, связанную в первую очередь с отсутствием информации о величине
фактора ориентации k [15,18],
такого рода измерения могут быть весьма полезны для быстрого полуколичественного
анализа величин расстояний. Тетрамерная форма организации апоЕ в растворе
продемонстрирована в нашем предыдущем исследовании [6], а также в работах
других авторов [4, 5, 22] с использованием анизотропии флуоресценции апоЕ/F
[6], гель-фильтрации [5,6,22], “сшивающих” агентов (рис.
4, [5,6]) и седиментационного анализа [5].
Существенно более выраженное снижение интенсивности
флуоресценции флуоресцеиновых групп при холодовой ренатурации апобелка,
после его денатурации гуанидин-гидрохлоридом (данные не приведены) или
после мономеризации холатом Na (см. таблицу),
по сравнению с изменением интенсивности свечения при инкубации при 24°С
указывает на наличие промежуточной стадии в сворачивании самоассоциированной
формы апоЕ. Этот конформационный переход происходит именно в самоассоциированной,
а не в мономерной форме апоЕ из-за быстрой самоассоциации в исследованной
области концентраций в физиологических условиях [6]. Обратимое снижение
интенсивности флуоресценции флуоресцеинового хромофора при ренатурации
апоЕ/Ф регистрировалось и в нашей предыдущей работе по денатурации/ренатурации
апобелка, измеренных в равновесных условиях [6]. Можно полагать, что холодовая
инкубация сопровождается накоплением “открытого” конформера тетрамера апоЕ.
Тепловая инкубация приводит к переходу “открытого” конформера самоассоциированной
формы апобелка в “закрытый”, т.е. схему поведения апоЕ в растворе, предложенную
нами ранее [6], можно дополнить на основании равновесных измерений: олигомер
(при старении препарата)
тетрамер “закрытый” тетрамер
“открытый” нативный или
частично денатурированный мономер
полностью денатурированный мономер.
Какова же природа сил, стабилизирующих
надмолекулярную структуру апобелка при его самосборке в растворе? Отмеченная
разница в температурной зависимости изменения интенсивности флуоресценции
апоЕ/Ф указывает на вовлеченность гидрофобных взаимодействий. Известно,
что гидрофобное “сцепление”, возникающее между алифатическими радикалами,
более стабильно при комнатной температуре, чем при 0°С, из-за эндотермичности
перехода от воды к неполярному растворителю для этих групп [19]. Именно
этим объясняется факт холодовой денатурации
многих белков [20]. Предположению о вовлеченности гидрофобных взаимодействий
в процесс структурирования тетрамера апоЕ соответствуют данные о значительном
снижении доступности флуоресцеинового хромофора для анионов I–
при инкубации апобелка при 24°С, по сравнению с отсутствием изменений доступности
при инкубации при 0°С (см. таблицу). В то же
время нельзя исключить и участия спаривания зарядов при самоассоциации
апоЕ, так как “сшивка” водорастворимым карбодиимидом приводила к образованию
тетрамерной формы апоЕ (рис. 4). Увеличенным
структурированием, т.е. большей плотностью упаковки белковой молекулы при
24°С, объясняется и снижение величины r
при инкубации апоЕ/Ф при 24°С и отсутствие заметных изменений этого параметра
за 6 часов инкубации при 0° (см. таблицу). Отметим,
что падение анизотропии флуоресценции вряд ли можно объяснить снижением
интегральной интенсивности, так как снижение квантового выхода может сопровождаться
лишь уменьшением времени жизни возбужденного состояния, что может приводить
лишь к росту величины r. Структурирование
тетрамерной формы апоЕ с образованием и конденсацией гидрофобного “ядра”,
вместе с тем, не приводит к заметным изменениям расстояний между центрами
“светящихся сфер” – отдельных молекул апоЕ в тетрамерном ассоциате – так
как величина E не изменялась
при инкубации при обеих температурах (см. таблицу).
Из этого также следует, что в изученном временном интервале не наблюдалось
и значительной самоассоциации в более высокомолекулярные олигомерные формы
апобелка. Открытым остается вопрос о достижении равновесной ситуации по
разным флуоресцентным параметрам (см. таблицу).
Если по результатам измерения r
можно полагать, что достигается равновесие после 6 часов инкубации при
24°С, то интенсивность флуоресценции апоЕ/Ф продолжала падать. Требуется
более детальное изучение кинетики изменения различных параметров.
Биологическая значимость обнаруженной надмолекулярной
организации апоЕ в растворе может заключаться в контролировании встраивания
молекул апобелка в липидную фазу липопротеидных частиц и клеточных мембран
и контролировании степени агрегированности апобелка в липиде, что, в свою
очередь, может определять эффективность взаимодействия апоЕ-содержащей
липопротеидной частицы с В,Е- или Е-рецепторами. Выявленный в данном исследовании
факт медленного сворачивания апоЕ после действия детергента поднимает вопрос
о равновесном состоянии апобелка в апоЕ-фосфолипидных рекомбинантах, полученных
при диализе из детергентного раствора. Эти структуры могут быть кинетически
нестабильны, если сворачивание апобелка в липидной фазе напоминает его
самоассоциацию в растворе. Конформационно неустойчивым может быть также
апобелок после диссоциации от поверхности ЛОНП и хиломикронов при их липолизе,
и взаимодействие липид-свободного апоЕ с сывороточным альбумином, показанное
нами [23], может тогда стабилизировать структуру апоЕ в сыворотке.
Работа выполнена при финансовой поддержке
Российского Фонда Фундаментальных Исследований, грант 98-04-48060.
[На
список литературы] [На
оглавление] [На
список сокращений и обозначений]
Copyright ©
|