В учебном пособии рассматриваются основы современной масс-спектрометрии органических соединений: методы ионизации и разделения ионов, физико-химические аспекты процессов масс-спектрометрической фрагментации, наиболее важные направления фрагментации важнейших классов органических соединений, аналитические аспекты масс-спектрометрии, а также области применения масс-спектрометрии. Большой раздел посвящен масс-спектрометрии биоорганических соединений. Отдельная глава повествует о масс-спектрометрии без пробоподготовки. Основное внимание уделено подходам для установления структуры органических соединений по масс-спектрам. Этот материал подкреплен большим количеством задач, решение которых позволит получить практические навыки работы со спектрами.

Для студентов старших курсов химических, биохимических, химико-технологических, биомедицинских и экологических специальностей, а также аспирантов, преподавателей и научных сотрудников, работающих в перечисленных выше областях.

Благодарности

Автор выражает благодарность за помощь в работе над книгой Вячеславу Борисовичу Артаеву, Дмитрию Михайловичу Мазуру, Алексею Александровичу Сысоеву.

Содержание

Вся информация вселенной заложена в массе.
Р. А. Зубарев

Предисловие ко второму изданию

В 2013 году научная общественность отметила 100-летие масс-спектрометрии, за дату рождения которой было решено принять выход в свет публикации Дж.Дж. Томсона «Rays of positive electricity». Это и много, и одновременно мало. Важно, что масс-спектрометрия в начале XXI века не превратилась в изученный вдоль и поперек рутинный метод анализа с известными непреодолимыми недостатками и ограничениями, а, напротив, развивается семимильными шагами.

Десятьлет прошло с момента выхода в свет первого издания «Масс-спектрометрия в органической химии». Это очень большой период для современной науки. Для масс-спектрометрии — это огромный период. За это время масс-спектрометрия стала самым востребованным методом аналитической химии, с помощью которого выполняется наибольшее число анализов. В распоряжении исследователей появились не просто новые модели, а новые типы масс-спектрометров. Орбитальные ловушки, разработанные А.А. Макаровым, о которых фирма «Термо» впервые официально объявила в 2005 году, завоевали повсеместное признание исследователей и стали наиболее желанными приборами масс-спектрометристов во всем мире. Очень значительно выросла роль времяпролетных приборов. На базе сверхвысокого разрешения появились новые направления науки: гуминомика, петролеомика. Потрясающие успехи достигнуты в протеомике, метаболомике. В конце 2014 года осуществлена посадка космического аппарата «Розетта» на комету Чурюмова — Герасименко. Это выдающееся научное достижение. Среди оборудования «Розетты» важную роль играет ROS1NA - прибор для анализа ионов и нейтральных частиц, который состоит из двух масс-спектрометров: двухфокусного магнитного секторного и рефлектронного времяпролетного. Этот факт демонстрирует важность масс-спектрометрии для современной науки, для получения наиболее надежных экспериментальных данных. Очень интересные результаты можно получать с помощью изотопной масс-спектрометрии. Метод масс-спектрометрической визуализации (имиджинга) позволяет изучать распределение искомых соединений по поверхности или всему объему изучаемого объекта. Масс-спектрометрические методы стали широко использоваться для диагностики самых разных заболеваний, для контроля хирургических операций.

За последние 10 лет изменилась терминология. Введено более сотни новых терминов, рекомендовано переименовать ряд существовавших названий. Даже классический метод ионизации «электронный удар» теперь следует называть «электронная ионизация». Возникло необычайно перспективное направление — масс-спектрометрия с ионизацией на открытом воздухе. Создано несколько десятков методов ионизации, которые позволяют работать с минимальной или вообще без пробоподготовки. Это устраняет последний практический недостаток масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия сегодня - это наиболее быстрый, чувствительный и информативный метод анализа химических и биологических соединений любой сложности: от химических элементов до биополимеров (белки, сахара, нуклеиновые кислоты). Можно утверждать, что, если для какого-нибудь соединений вы не можете найти масс-спектрометрическую методику его определения, это означает только то, что оно до сих пор не интересовало масс-спектрометристов. Существенные успехи достигнуты в области миниатюризации. Созданы переносные масс-спектрометры весом в несколько килограммов. В результате появились предпосылки для создания в недалеком будущем бытовых масс-спектрометров для проверки качества пищевых продуктов, напитков, медикаментов и т.д

Значительные перемены произошли и в российской масс-спектрометрии. В конце 2003 года создано Всероссийское масс-спектрометрическое общество (ВМСО), объединившее около 600 ученых более чем из 50 регионов страны, ближнего и дальнего зарубежья и ставшее полноправным членом международного масс-спектрометрического общества (International Mass Spectrometry Foundation, IMSF). ВМСО уже проведено шесть крупных масс-спектрометрических конференций с международным участием, ежегодно проводятся школы по разным аспектам масс-спектрометрии. С 2004 года в свет выходит журнал «Масс-спектрометрия», включенный в список ВАК и переводимый на английский язык в качестве ежегодного приложения к «Журналу аналитической химии». Журнал хорошо цитируется, а по импакт-фактору РИНЦ в 2013 году он оказался на втором месте среди всех российских журналов в области химии и на пятом в области физики. Золотые медали ВМСО за выдающиеся заслуги в масс-спектрометрии вручены российским ученым с мировыми именами: Б.А. Мамырину, А.А. Макарову, Л.Н. Галль, И.А. Ревельскому, Р.А. Зубареву. Престижные Международные премии получили наши соотечественники: В.Л. Тальрозе (премия Томсона), А.А. Макаров (премии Томсона, Брюне, Американского масс-спектрометрического общества), Р.А. Зубарев (премии Брюне и Бимана), Ю. Ласкин (премия Бимана, премия Rising Star Award from the Women Chemists Committee of the American Chemical Society). Золотыми медалями Питсбургской конференции в XXI веке награждены два масс-спектрометра: орбитальная ловушка фирмы «Термо», разработанная А.А. Макаровым, ивремяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения HRT фирмы Л ЕКО, разработанный А.Н. Веренчиковым и В.Б. Артаевым. За прошедшие 10 лет активизировался выпуск специализированной масс-спектрометрической литературы на русском языке. Вышедшие монографии российских авторов и переводы зарубежных изданий были посвящены разным направлениям масс-спектрометрии [1-7].

Таким образом, изменений и новшеств накопилось так много, что выпуск нового, существенно переработанного и дополненного учебного издания по органической масс-спектрометрии стал необходим. Изменения коснулись практически всех глав. Добавлены новые главы по ионизации на открытом воздухе, по родственным масс-спектрометрии методам анализа, по масс-спектрометрии биологических соединений. В тексте использована новая терминология в соответствии с рекомендациями ВМСО и IMSF. Большое количество иллюстративного материала позволит легче воспринимать материал. Добавлены новые задачи, необходимые при проведении обучающих семинаров.

Что такое «масса», благодаря чему она
приобретает способность оказывать такое влияние
на душевную жизнь индивида?
3. Фрейд. Психология масс и анализ человеческого «Я»

Теория становится материальной силой,
как только она овладевает массами.
К. Маркс. К критике гегелевской философии права

Предисловие

К концу XX века инструментальные физико-химические методы анализа стали неотъемлемой частью экспериментальной работы исследователя, работающего в области естественных наук. Наиболее мощными и многоцелевыми среди них, безусловно, являются спектроскопия ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрия. Оба метода активно используются в химии, биологии, медицине, экологии, контроле технологических процессов, криминалистике и т.д. Характеризуя вновь синтезированное вещество, исследователь обязан получить и описать его ЯМР и масс-спектры.

Говоря о достоинствах масс-спектрометрии, следует прежде всего отметить ее чувствительность, экспрессность, информативность и надежность. Для получения достоверного масс-спектра индивидуального соединения даже на рутинном масс-спектрометре достаточно 10^-9-10^-10 г вещества. При необходимости простого детектирования конкретного соединения в смеси порог обнаружения может быть легко снижен до 10^-12-10^-14 г. Использование современного оборудования и современных методов ионизации позволяет в некоторых случаях увеличить чувствительность метода еще на несколько порядков. Таким образом, «традиционная неразрешимая» без волшебства русская задача о «поиске иголки в стоге сена» может бытьлегко решена масс-спектрометрически, а обычный масс-спектрометрический эксперимент сравним с поиском одной иголки в нескольких миллионах стогах сена.

Для получения обычного спектра электронной ионизации индивидуального соединения необходимо затратить 1-2 минуты, а время анализа сложной смеси органических соединений в режиме хроматомасс-спектрометрии определяется исключительно хроматографическим временем удерживания компонентов. При этом в памяти компьютера, являющегося неотъемлемой частью современного масс-спектрометра, остается информация о временах удерживания, площадях пиков, атакже масс-спектры всех компонентов смеси, то есть, вводя в прибор один микролитр сложнейшей смеси органических соединений, на «выходе» можно получить информацию о ее качественном и количественном составе. Ни один другой метод не сочетает в себе такой экспрессности и информативности. Надежность масс-спектрометрического анализа также очень высока, поскольку масс-спектр является индивидуальной характеристикой конкретного вещества, отражающей его структурные особенности.

История масс-спектрометрии насчитывает около 100 лет. Годом рождения масс-спектрометрии можно считать 1901-й, когда немецкий физик В. Кауфман создал первый прототип параболического масс-спектрографа для изучения «катодных лучей», или 1913-й, когда сэр Дж. Томсон впервые спектрально увидел изотопы Предисловие неона, или 1918-й, когда А. Демпстер сконструировал первый магнитный масс-спектрометр с источником для электронной и термической ионизации. Тем не менее в течение первых 50 лет существования эта наука оставалась прерогативой исключительно физиков и физико-химиков. Используя простейшие соединения, масс-спектрометристы того времени успешно измеряли характеристики элементов, атомов, молекул (энергии ионизации, прочности связей, точные массы элементов и природную распространенность их изотопов).

Временем рождения органической масс-спектрометрии можно считать конец 40-х — начало 50-х годов прошлого века. Это было совсем недавно, поэтому даже сейчас, в начале XXI века, можно лично поговорить с классиками, стоявшими у истоков создания этой дисциплины. После Второй мировой войны возникло понимание, что метод можно использовать не только в качестве прецезионного физико-математического инструмента, но и в качестве удобного способа идентификации достаточно сложных соединений по набору характеристических для них фрагментных ионов. Знание классических химических реакций органических соединений и привлечение теорий устойчивости органических ионов позволяет приписать фрагментам конкретные структуры, делать обобщения по аналогиям фрагментации внутри классов органических соединений. Переход на такой уровень масс-спектрометрии резко увеличил число пользователей метода и привел к взрывному процессу развития приборного парка. Особенно важной оказалась применимость метода для решения нефтехимических проблем. Финансовые вложения нефтяных компаний значительно помогли быстрому инструментальному и теоретическому становлению нового научного направления. Отличное издание [8], содержащее огромный фактический материал по истории масс-спектрометрии и богато иллюстрированное фотографиями и рисунками, вышло в свет в 2002 году под редакцией М. Грейсона по случаю 50-летия масс-спектрометрического общества США.

Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения двух основных проблем: идентификации и количественного определения веществ, а также изучения превращений ионизированных молекул органических соединений в газовой фазе в ионном источнике |9]. С появлением хроматомасс-спектрометрии, ионного циклотронного резонанса [10], систем протока после разряда [11] возможности классического метода значительно увеличились. Соединение масс-спектрометра с жидкостным хроматофафом еще более расширило круг изучаемых объектов. Новые методы ионизации, в частности «электроспрей» [12] и МАЛДИ [13], появившиеся к концу XX века, позволили успешно работать со сложнейшими биоорганическими молекулами, такими как полипептиды, белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, молекулярные массы которых составляют миллионы дальтон [14]. На сегодняшний день можно проанализировать соединение практически любой сложности. В последние годы широко ведутся исследования по анализу микроорганизмов [15], по моделированию в газовой фазе химических реакций термолиза, фотолиза, превращений, катализируемых кислотами и основаниями [16], по изучению каталитических процессов [17]. По шутливому выражению одного из «отцов» органической масс-спектрометрии Фреда Мак-Лафферти, «если химическую задачу нельзя решить с помощью масс-спектрометрии, может быть, Предисловие она вообще не стоит того, чтобы на нее тратили время» [18]. Признанием важности масс-спектрометрии для развития современной науки стало присуждение в 2002 году Нобелевской премии масс-спектрометристам Джону Фенну и Кончи Танаке.

Наряду с очевидным использованием масс-спектрометрии в органической и биоорганической химии для установления структур соединений, хроматомасс-спектрометрия стала сегодня основным методом идентификации и количественного определения органических загрязнений в объектах окружающей среды. Современная химическая экология немыслима без этого метода. Изучение метаболизма лекарственных средств и пестицидов в окружающей среде и живых организмах также ведется с активным использованием масс-спектрометрии. Метод незаменим в криминалистических исследованиях и при проведении допинг-контроля на спортивных соревнованиях.

Масс-спектрометрия применяется для решения геохимических и космохимических проблем, задач комбинаторной химии, иммунологии, медицины, биологии и т.д. Масс-спектрометрия имеет явное преимущество перед другими физико-химическими методами, поскольку в этом случае речь идет о простейших характеристиках вещества: массе молекулы, ее основных фрагментов и отношении количеств этих фрагментов относительно друг друга. Это позволяет достаточно легко усвоить основы метода и научиться работать с масс-спектрами не только подготовленным студентам, но и школьникам старших классов, изучающим курс органической химии. Учитывая, что расшифровка масс-спектра может быть сродни решению головоломки типа puzzle, научиться владеть этим методом настолько же полезно, насколько просто и увлекательно.

Тем не менее, занимаясь масс-спектрометрией органических соединений уже более 30 лет, я постоянно сталкиваюсь с ситуацией, когда даже опытные химики-органики пасуют перед масс-спектром, предпочитая извлечь необходимую информацию о структуре с помощью других, более знакомых им методов. Объяснение этому я нахожу в отсутствии учебной литературы по интерпретации масс-спектров и спецкурсов по этой дисциплине в вузах России. Книги по масс-спектрометрии советских авторов, изданные в 70—80-е годы прошлого века, затрагивали отдельные аспекты органической масс-спектрометрии [19-39], причем в качестве учебной литературы можно было бы выделить лишь пособия [24-27]. Русскоязычный читатель не был знаком и с подавляющим большинством иностранных изданий. За исключением фундаментальной пионерской монографии Джона Бейнона [9], на русский язык были переведены лишь три книги [40-42], две из которых [40,41 ] относятся к 60—70-м годам XX века. Даже замечательный учебник Мак-Л афферти [43], претерпевший уже четыре издания, так и не переведен на русский язык. В XXI веке ситуация несколько изменилась. Прежде всего это связано с созданием Всероссийского масс-спектрометрического общества. Его деятельность привела к написанию и переводу современных книг по масс-спектрометрии [1-7], а также первого издания этого учебного пособия [44].

Данное пособие направлено на решение двух основных задач: учебной и познавательной. Можно знакомиться с материалом последовательно, а можно выборочно читать конкретные главы или разделы. Большое внимание уделено именно работе с масс-спектром, подходам к его расшифровке с извлечением максимальной Предисловие структурной информации. Описание основных направлений фрагментации различных классов органических соединений (от алканов до белков и нуклеиновых кислот) сопровождается задачами, аналогичными тем, с которыми сталкивается любой исследователь, когда обращается к методу масс-спектрометрии в своих научных целях. Решая эти задачи, читатель сможет закрепить теоретический материал и успешно справляться с подобными проблемами в своей последующей научной работе. Большое число вариантов типовых задач позволяет использовать книгу не только для индивидуальной работы, но и для семинаров в студенческих группах.

масс-спектрометрии. В данной работе наряду с описанием классических методов ввода и ионизации образца, а также разделения и детектирования ионов значительное место уделено теоретическим и практическим аспектам современной масс-спектрометрии: электрораспылению и другим методам стыковки жидкостного хроматографа с масс-спектрометром, матрично активированной лазерной десорбции/ионизации (гл. 5),тандемной масс-спектрометрии (гл. 7), методам анализа, основанным или связанным с масс-спектрометрией (гл. 8), методам ионизации без пробоподготовки (на открытом воздухе, гл. 9).

Очень важно, чтобы масс-спектрометрией владели непосредственно химики, биологи, экологи, а не узкий круг профессиональных масс-спектрометристов. Никто не знает столь досконально свою задачу, как человек, непосредственно работающий с веществом. Если он сможет правильно поставить масс-спектрометрическую задачу и при этом владеет техникой интерпретации масс-спектров, эффективность его работы со спектрами будет существенно выше, чем у профессионального масс-спектрометриста, далекого от конкретной проблемы. Недостающим звеном для правильной расшифровки может оказаться информация о производителе исходного реактива, о побочных процессах изучаемой реакции, о примесях к реагентам или даже о реакции, которая ставилась в этой посуде за неделю до данного эксперимента

Мир масс-спектрометрии удивителен и красив. Каждый год приносит новые потрясающие открытия, появляются неординарные приложения этого метода. Я надеюсь, читатель сможет оценить это сам.